이은주는 1996년 스마트학생복 모델 선발대회에서 은상을 타며 연예계에 발을 들였다. 이듬해인 1997년 KBS 드라마 '스타트'를 시작으로 '백야 3.98', '카이스트', '납량특선 8부작', TV소설 '누나의 거울', '성난 얼굴로 돌아보라', '불새'에 출연했다.
이은주는 청순한 외모와 차분한 분위기, 수려한 연기력으로 특히 충무로에서 주목받았다. 그는 첫 주연작이었던 영화 '오! 수정'에서 양수정 역을 연기해 그해 대종상 신인여우상을 탔다. 영화 '번지점프를 하다', '연애소설', '하얀 방', '하늘정원', '안녕! 유에프오', '태극기 휘날리며'에 출연하며 필모그래피를 쌓았다.
치정과 살인 등을 다룬 로맨스·스릴러 '주홍글씨'에서 이은주는 가정이 있는 남성과 내연 관계인 매혹적인 여성 가희 역을 연기하며 이미지 변신에 성공했고 연기로도 호평을 받았다. 하지만 이 작품은 그의 유작이 되고 말았다.
이은주는 2005년 2월 22일 사망했다. 향년 25세. 고인의 유해는 경기도 고양시 일산 청아공원 납골당에 안치돼 있다.